Mengenal Teknik DNA Sequencing
Meskipun begitu, teknik lama berbasis chain-termination masih umum digunakan, bahkan sangat efisien untuk menentukan sekuen DNA fragmen pendek (masih dalam hitungan kilobasa). Jadi ditemukannya teknik DNA Sequencing yang lebih canggih tidak serta merta bakal menggusur mesin-mesin capillary sequencing yang sudah “merajalela” di berbagai laboratorium biologi molekuler di seluruh dunia.
Artikel ini akan membahas prinsip dasar dan protokol DNA sequencing berbasis metode chain-termination menggunakan mesin automated capillary sequencer.
Prinsip Dasar DNA Sequencing
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.
Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:
· Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR
· ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.
Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini?
Cara Klasik
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.
Prinsip Sanger Method dengan primer labelling
Dye Primers dengan Label Berbeda
Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?
Dye-Terminators Sequencing
Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.
Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.
Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya.
Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini –meskipun kini tergolong “lambat” setelah ditemukannya high-throughput sequencing– akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.
Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing
Ekstraksi DNA untuk DNA sequencing
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.
Desain Primer dan Amplifikasi
Urutan kerja DNA sequencing secara umum mengharuskan kita mengamplifikasi hasil ekstraksi DNA sample sebelum disekuen. Untuk mengamplifikasi DNA sample, kita membutuhkan DNA polymerase, nukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler.
Sequencing Chemistries
Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.
Sequencing menggunakan Dye Primers
Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dye fluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).
Sequencing menggunakan Dye Terminators
DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (gambar 3).
BigDye® Cycle Sequencing Chemistries
BigDye® primers dan terminators mengutilisasi molekul-molekul transfer energi tunggal, yang mencakup sebuah pewarna (dye) donor dan akseptor energi yang terhubung oleh sebuah penghubung (linker) transfer energi yang sangat efisien. Dalam struktur molekul BigDye®, akseptornya adalah sebuah dye dichlororhodamine. Dye dichlororhodamine (dRhodamine) merupakan suatu penyempurnaan atas dye rhodamine konvensional. dRhodamine terpisah lebih baik secara spektral — terdapat overlap spektral yang jauh lebih sedikit pada panjang gelombang eksitasi maksimumnya, dan produk sequencing yang dihasilkan memperlihatkan background noise yang jauh berkurang. Sehingga menghasilkan signal yang lebih bersih dan akurasi base calling yang lebih besar pada pembacaan yang lebih panjang. Suatu linker transfer energi meng-couple fluorescein donor dan dye dRhodamine akseptor untuk transfer energi yang efisien dalam satu molekul tunggal. Dye yang lebih terang dan bersih ini menghasilkan sebuah sequencing chemistry yang sesuai untuk kebanyakan aplikasi.
Pemurnian sample
Setelah reaksi sequencing, sangat penting untuk membuang dye terminators yang tidak menempel dan garam-garam yang dapat berkompetisi saat injeksi elektrophoresis kapiler. Terminator yang tidak menempel dapat turut bermigrasi bersama template sequencing, mengakibatkan basecalling errors dan kelebihan garam mengakibatkan rasio signal-to-noise menjadi buruk.
Elektroforesis
Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencing diinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.
Beberapa saat sebelum mencapai elektroda positif, fragmen DNA terlabel fluorescent yang terpisah berdasarkan ukuran, bergerak melalui lintasan sinar laser. Sinar laser menyebabkan dye pada fragmen berpendar. Sebuah alat pendeteksi optis pada mesin DNA analyzer mendeteksi fluorescent (gambar 5). Software Data Collection mengkonversi signal fluorescent menjadi data digital, kemudian merekam datanya dalam sebuah file *.ab1. Karena masing-masing dye mengemisikan cahaya pada panjang gelombang yang berbeda ketika tereksitasi oleh laser, sehingga keempat warna yang mewakili keempat basa dapat dideteksi dan dibedakan dalam satu injeksi kapiler.
Analisa Data
Setelah elektroforesis, software Data Collection membuat sebuah file sample dari data mentah. Dengan menggunakan aplikasi software, analisa data selanjutnya diperlukan untuk menterjemahkan image data warna yang diperoleh menjadi basa-basa nukleotida yang berhubungan.
Analisa Primer
Tool-tool ini mengkonversi gambar yang diperoleh selama Data Collection menjadi empat warna, yang merepresentasikan keempat basa nukleotida yang berhubungan (gambar 1). Sebagai contoh, Software Sequence Analysis adalah perangkat analisa primer yang harus digunakan setelah pengumpulan data selesai. Aplikasi software Sequence Analysis memungkinkan pengguna untuk melakukan basecall dan basecall ulang, memotong ujung data, menampilkan, menyunting dan mencetak file-file sample. Software analisa primer memproses data mentah pada file *.ab1 menggunakan algoritma dan menerapkan pengaturan analisa berikut kepada hasil:
Basecalling
Koreksi Pergeseran Mobility
File Mobility mengkompensasi perubahan dalam mobilitas fragmen DNA yang disebabkan oleh molekul dye yang terikat pada fragmen DNA dan mengubah penetapan warna basa-basa bergantung pada jenis chemistry yang digunakan untuk melabel DNA.
Quality Value (QV)
Jika menggunakan KB basecaller untuk analisa, software memberikan suatu QV untuk setiap basa. QV memprediksi probabilitas suatu galat basecall. Contohnya, suatu QV 20 memprediksi tingkat galat 1%. Algoritma pemrediksi kualitas dikalibrasi untuk memperoleh QV yang memenuhi hubungan standar-industri yang ditetapkan oleh software Phred. Jika alur kerja kita mencakup analisa menggunakan software Phred untuk memberikan QV setelah data di-basecall, kita dapat menyederhanakan workflow dan menggunakan KB Basecaller saja. KB Basecaller dapat melakukan basecalling dan memberikan QV. Kemudian, kita dapat membuat file *.phd.1 atau *.scf menggunakan KB Basecaller untuk diintegrasikan dengan workflow kita.
Analisa Sekunder
Tool-tool ini memungkinkan kita untuk lebih menyempurnakan hasil. Algoritma dalam produk-produk software analisa sekunder melakukan sejumlah aplikasi pendukung fungsi-fungsi seperti deteksi mutasi dan genotyping, dan menghasilkan output-output grafis.
Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing
|
|
|
|
DNA polymerase dapat berinkorporasi juga dengan basa nukleotida analognya. Metode dideoksi pada DNA sequencing yanG dikembangkan oleh Sanger et al. (1977) memanfaatkan keuntungan kemampuan ini dengan menggunakan 2′-3′-dideoksi sebagai substrat. Ketika sebuah dideoksinukleotida berinkorporasi pada ujung 3′ rantai yang sedang memanjang, pemanjangan rantai dihentikan secara selektif pada A, C, G atau T, karena rantai kekurangan gugus 3′-hidroksil (lihat gambar 8).
Gambar 8: Empat warna/sequencing fluorescent satu lajur vs Satu warna/Sequencing Empat Lajur
2. Apakah Cycle Sequencing itu?
| Cycle Sequencing adalah sebuah metode sederhana dimana pengulangan denaturasi, annealing dan ekstensi secara berturut-turut dalam thermal cycler menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi (lihat gambar 9). Produk ini kemudian di-load kedalam del atau diinjeksikan ke dalam kapiler. Applied Biosystems menggunakan protokol cycle sequencing ini dalam kit DNA sequencingnya. |
|
|
3. Apakah keuntungan dari cycle sequencing?
Keuntungannya adalah sebagai berikut:
· Protokolnya sangat baik dan mudah untuk dilakukan
· Cycle sequencing membutuhkan DNA template yang jauh lebih sedikit dibandingkan metode ekstensi temperatur tunggal.
· Cycle sequencing lebih sesuai dibandingkan metode pelabelan temperatur tunggal tradisional yang membutuhkan langkah denaturasi kimiawi untuk template utas ganda.
· Temperatur yang tinggi mengurangi struktur sekunder sehingga ekstensi berjalan lebih sempurna
· Temperatur tinggi mengurangi annealing sekunder primer ke template
· Protokol yang sama digunakan untuk DNA utas ganda maupun utas tunggal
· Protokol ini bekerja dengan baik untuk sequencing langsung PCR produk
· Template-template yang sulit, seperti bacterial artificial chromosomes (BACs), dapat disekuen
4. Apakah Dye Terminator Cycle Sequencing itu?
| Dengan pelabelan dye terminator, masing-masing keempat dideoxy terminators (ddNTPs) ditandai dengan suatu fluorescent dye yang berbeda-beda. Rantai yang tumbuh diterminasi dan dilabel secara simultan dengan dye yang berkorespondensi dengan basa tersebut (lihat gambar 10). Suatu primer yang tidak dilabel dapat digunakan. Reaksi dye terminator dapat dilakukan dalam sebuah tabung. Protokol ini membutuhkan langkah pemipetan yang lebih sedikit dibanding reaksi dye primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load dalam sebuah lajur gel tunggal atau satu injeksi kapiler. Jika terjadi kesalahan terminasi, yaitu fragmen yang tidak diterminasi oleh dideoksinukleotida, maka tidak akan terdeteksi karena tidak ada dye yang menempel. |
5. Apakah Dye Primer Cycle Sequencing itu?
| Dengan pelabelan dye primer, primer ditandai dengan empat pewarna fluorescent yang berbeda. Produk terlabel terbentuk dalam empat reaksi spesifik basa yang berbeda. Produk dari keempat reaksi ini lalu dicampur dan di-load kedalam satu lajur gel atau satu injeksi kapiler (lihat gambar 11). Dye primer chemistries umumnya menghasilkan intensitas sinyal yang lebih baik dibanding dye terminator chemistries. Primer yang terlabel tersedia secara komersial untuk situs-situs primer yang umum. Kita dapat juga melabel custom primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load ke dalam lajur tunggal atau satu injeksi kapiler. |
6. Apakah Matrix Standard itu?
Overlap spektral yang presisi antara keempat dye diukur dengan menjalankan (running) fragmen DNA yang dilabel menggunakan masing-masing dye dalam kalibrasi spektral pada mesin ABI PRISM® Genetic Analyzer. Fragmen DNA yang dilabel dye ini dinamakan matrix standards. Software Data Utility kemudian menganalisa data dari sample matrix standard dan membuat file matrix. Nomor-nomor ini adalah internetan fluorescent yang dinormalisasi dan merepresentasikan suatu deskripsi matematis overlap spektral yang teramati diantara dye-dye. File-file matrix dalam file instrumen digunakan untuk jenis chemistry yang spesifik, dan menyediakan informasi bagi software Sequence Analysis sehingga memungkinkannya untuk mengkoreksi overlap spektral.
7. Apakah BAC End-Sequencing itu?
Bacterial artificial clones alias BAC adalah segmen besar DNA (100kb-200kb) yang diklonkan ke dalam bakteri dari spesies lain. Beberapa salinan dapat dibuat setelah kloning. Sekuen dari ujung BAC menyediakan penanda yang sangat spesifik. Sekuen ini kemudian dapat dibandingkan dengan pustaka BAC untuk konformasi.
8. Apakah yang dimaks dengan “Checking Clone Constructs”?
Ini merupakan cara untuk memverifikasi bahwa DNA yang kita inginkan sudah diklon dengan baik kedalam vektor menggunakan DNA sequencing.
9. Apakah Multicomponent Analysis itu?
| Multicomponent analysis merupakan proses yang memisahkan keempat warna dye fluorescent menjadi komponen-komponen spektral tersendiri. Meskipun setiap dye mengemisikan fluoresensi maksimumnya pada panjang gelombang yang berbeda, terdapat beberapa overlap pada spektrum emisi antara keempat dye (lihat gambar 12). Tujuan multicomponent analysis adalah mengisolasi signal dari setiap dye sehingga noise pada data menjadi sesedikit mungkin. |
10. Apakah De Novo Sequencing itu?
Proses eksperimental penentuan urutan basa nukleotida suatu daerah (region) DNA dengan melabel setiap nukleotida dengan penanda fluorescent untuk mengidentifikasinya.
11. Apakah yang dimaksud dengan Multi-Locus Sequence Typing (MLST)?
MLST adalah suatu prosedur yang tidak ambigu untuk mengkarakterisasi isolat bakteri menggunakan sekuen fragmen internal dari 7 gen housekeeping. Prosedur ini menggunakan fragmen internal (~450-500 bp) dari setiap gen, sehingga mereka dapat disekuen pada kedua utasnya secara akurat dengan mesin DNA sequencer terotomatisasi. Untuk setiap gen housekeeping, sekuen-sekuen yang terdapat dalam suatu spesies bakteri dinyatakan sebagai alel yang jelas, dan untuk setiap isolat, alel pada masing-masing ketujuh loci mendefinisikan profice allelic atau jenis sekuen (IST)
12. Apakah yang dimaksud dengan Deteksi berbasis SNP atau Resequencing?
Sebuah heterozygote mengandung alel-alel yang berbeda pada suatu locus (posisi) pada kromosom homolog. Deteksi heterozygote dilakukan dengan primer spesifik.
13. Apakah HLA Typing itu?
Pengujian human leukocyte antigen (HLA) mendeteksi antigen-antigen (penanda genetik) pada sel darah putih. Terdapat 4 jenis human leukocyte antigens yaitu: HLAA, HLAB, HLAC, dan HLAD. Tes HLA menguji kompatibilitas jaringan dan penentuan jenis jaringan reseptor/donor. Tes ini juga digunakan pada konseling genetik dan pengujian paternitas. (hanya untuk riset.)
14.apakah Deteksi Metilasi itu?
Metilasi DNA terjadi pada situs CpG, yang mana sekuen DNA dengan sitosin berada dekat dengan guanin. Metilasi dimediasi oleh suatu enzim (DNA methyltransferase). Situs CpG jarang terdapat pada genom eukariot, kecuali pada wilayah yang dekat dengan promoter suatu gen eukariotik. Wilayah ini dikenal sebagai CpG islands, dan keadaan metilasi pada situs-situs CpG penting bagi aktifitas/ekspresi gen.
15. Apakah mtDNA sequencing itu?
mtDNA adalah kependekan dari mitokondria. Molekul mitokondrial terdapat dalam jumlah 100-1000 salinan per sel, lain dengan DNA inti yang terdapat hanya dua salinan per sel. Banyaknya mtDNA memungkinkan diskriminasi antara individu-individu atau sampel-sampel biologis, khususnya jika DNA inti rusak atau tidak tersedia.
16. Apakah yang dimaksud dengan Comparative Genomic Resequencing?
Comparative Genomic Resequencing adalah perbandingan genom-genom dan individu-individu dalam suatu genom. Comparative genomics memungkinkan aplikasi informasi yang diperoleh dari suatu genom sampel menjadi suatu genom yang lebih kompleks. Ini merupakan dasar untuk memahami variasi genetik dalam suatu populasi.
17. Apakah Metode SAGE™ itu?
SAGE™ adalah sebuah motede untuk analisa kuantitatif, pola ekspresi gen pada genome. Suatu tag sekuen pendek (10 – 25 bp) mengandung informasi yang cukup untuk mengidentifikasi suatu transkrip.
18. Apakah yang dimaksud dengan profiling mutasi menggunakan analisa, deteksi atau validasi SNP itu?
Sebuah single nucleotide polymorphism (SNP) adalah substitusi satu basa atas yang lainnya. Beberapa metode berbasis sequencing tersedia untuk pencarian dan analisa SNP.
DAFTAR PUSTAKA
http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/
http://sciencebiotech.net/mengenal-teknik-dna-sequencing/
http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/
Tidak ada komentar:
Posting Komentar