Mekanisme Molekuler Induksi Tumor Crown Gall oleh Agrobacterium tumefaciens (PART 2)

1.2 PROSES-PROSES YANG TERLIBAT DALAM INDUKSI TUMOR CROWN GALL

Seperti yang telah disebutkan di atas, tumorigenesis dari Crown gall merupakan proses yang terdiri dari beberapa tahap termasuk penempelan Agrobacterium pada sel tanaman, proses dan transfer T-DNA ke sel tanaman diikuti oleh penggabungan dan pengekspresian gen-gen T-DNA di dalam genom tanaman.

1.2.1    Penempelan Agrobacterium pada Sel Tanaman

Tahap pertama dalam induksi tumor adalah pengikatan Agrobacterium pada sel tanaman. Peristiwa awal ini dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom bakteri. Strain yang membawa mutasi-mutasi sejumlah loci (chvA, chvB, att dan pscA atau exoC) kurang baik dalam penempelan sel tanaman, sehingga dikatakan avirulen atau sangat lemah sifat racunnya (8, 21, 53, 77, 83). Gen-gen kromosom, chvA, chvB, dan exoC, diperlukan dalam sintesis dan penyaluran  β-1,2-glucan cyclic yang terlibat dalam pengikatan sel tanaman. Protein chvB terlibat dalam biosintesis glucan (67), sementara chvA diperlukan untuk memindahkan glucan dari sitoplasma ke periplasma dan ruang ekstraseluler. ChvA memiliki kesamaan dengan  golongan ATPase yang terikat pada membran (membrane-bound ATPase) yang terlibat dalam transpor aktif (22). Walaupun produk-produk dari chvA dan chvB terlibat dalam biosintesis dan transpor β-1,2-glucan, namun masih belum jelas apakah glucan terlibat dalam penempelan Agrobacterium atau mempengaruhi sifat-sifat lain dari permukaan sel yang terlibat secara langsung.

Mutan-mutan att memiliki flagela, fimbriae dan mudah bergerak (motile) (53). Att normalnya memproduksi β-1,2-glucan dan tidak mengalami perubahan pada struktur polisakaridanya. Uji mendalam pada mutan-mutan ini menunjukan bahwa mutan-mutan ini kekurangan dua polipeptida (34 kDa dan 38 kDa), yang ditemukan pada membran luar atau ruang periplasma dari bakteri tipe liar (53). Namun, apakah salah satu dari dua polipeptida ini berperan secara langsung pada induksi tumor dengan cara memediasi proses penempelan, masih belum diketahui.

1.2.2    Induksi Gen-vir

Daerah vir kira-kira 30 kb dan tersusun dalam 7-8 komplementasi kelompok: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, dan virH (sebelumnya pinF) (73, 86). Gb. 5 menunjukan susunan genetik wilayah vir dari Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin. Perbedaan wilayah vir antara Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin adalah; virF dan virH (pinF) tidak terdapat pada Ti-plasmid tipe nopalin sementara tipe oktopin mengandung kedua gen tersebut.

Aktivasi transkripsi gen-gen vir merupakan hasil langsung dari penerimaan A. tumefaciens terhadap sinyal molekul yang diproduksi oleh sel tanaman yang luka, yang mana memicu sistem regulasi vir. Dua penginduksi potensial, acetosyringone dan hydroxy-acetosyringone, diisolasi dari sel akar tembakau oleh Stachel et al (72). Beberapa monosakarida juga memegang peranan penting pada induksi gen-gen vir (9). pH medium memiliki pengaruh yang kuat pada induksi vir; induksi akan optimal dalam rentang pH 5.0-5.4 dan tidak akan terjadi induksi pada pH 6.3 atau diatasnya (74). Regulasi gen vir juga dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom Agrobacterium. Gen virulen kromosomal yang dinamai chvD, chvE, ros, miaA, chvG, dan chvI telah dilaporkan terlibat dalam virulensi dengan cara mempengaruhi ekspresi gen-gen vir pada Ti-plasmid (85, 86, 89,36,28, 18, 10,51). chvD, ros, dan miaA memiliki peran yang sulit dimengerti dalam regulasi ekspresi gen vir. Penyelipan transposon pada chvE menyebabkan kisaran inang terbatas dan berkurang sifat racunnya. Induksi gen vir pada Ti-plasmid oleh acetosyringone berkurang sama sekali atau bahkan tidak terdapat dalam mutan chvE. Namun, induksi virG dengan kombinasi antara pH rendah dan konsentrasi posfat rendah tidak merusak mutan chvE  jika dibandingkan dengan tipe liar (wild type). Analisis susunan DNA menunjukkan bahwa chvE bisa mengkode protein ruang periplasmik yang terlibat dalam kemotaksis atau pengambilan gula (sugar uptake) (36). Mekanisme dimana protein ini mempengaruhi  induksi acetossyringone pada gen-gen vir masih belum diketahui. chvG dan chvI, anggota dari sistem regulasi dua komponen yang baru-baru ini diidentifikasi, juga terlibat dalam induksi gen vir dengan mekanisme yang belum diketahui (10,51).

Hal ini menunjukan bahwa gen-gen vir, virA dan virG yang esensial adalah regulator dari vir-regulon (86,1 ,55, 57). Protein VirA dan VirG harus melaksanakan setidak-tidaknya dua aktifitas yang berbeda. Yang pertama adalah kepekaan ekstraselular terhadap molekul sinyal tanaman dan transduksi dari sinyal lingkungan ini ke dalam bakteri. Yang kedua adalah pengaktifan beberapa vir-operon yang terpisah dalam merespon sinyal tanaman. Menariknya, protein regulasi virA dan VirG menunjukan kesamaan yang cukup berarti dengan beberapa protein bakterial yang termasuk dalam famili sistem regulasi positif dua komponen (87, 62). Produk VirA menyederhanakan protein membran bagian dalam yang peka dan merespon molekul sinyal tanaman seperti  acetosyringone (Gb. 6). Lebih lanjut, protein VirA merupakan kelompok kelas protein kinase histidin, dan mampu melakukan autoposporilasi (40, 58, 76). Pospat terikat pada sebuah residu histidine dari protein VirA. Hanya satu residu histidine yang terpelihara di antara protein-protein yang serupa. Ketika pengkodean kodon, residu ini (asam amino 474) diubah oleh site–directed mutagenesis menjadi glutamat, mutan virA ini tidak berfungsi dalam mengarahkan induksi gen vir dan mutan ini tidak bisa melakukan autoposporilasi (40). VirA yang mengalami autoposporilasi mentransfer pospat ke VirG (39). VirG adalah anggota protein perngatur respon (the respone regulator protein) (39), yang mana setengah dari N-terminalnya merupakan target dari posporilasi dan setengah C-terminalnya memiliki sifat pengikat promoter (promoter-binding properties) (54,62, 66). Pospat dilekatkan pada residu aspartat 52 dari protein VirG. Residu ini tersimpan dalam protein yang serupa dan dikenali sebagai tempat posporilasi (62). Perubahan aspartat ini menjadi asparagin menghilangkan kemampuan protein untuk menerima pospat dari VirA (39). Protein VirG digolongkan kedalam famili yang memiliki kesamaan susunan, yang disebut kotak vir (vir boxes), terletak pada bagian hulu (upstream) dari masing-masing promoter vir (66). Setengah bagian C-terminal dari protein virG bertanggung-jawab dalam pengikatan vir boxes (66). Penghilangan atau perubahan pada salah satu dari kedua vir boxes yang berada dalam gen VirG menghapus induksi dari promoter tersebut (63). Data yang sama  didapatkan saat vir boxes diubah atau dihapus dalam promoter virB, virC, VirD, dan virE (66,63, 61). Pengikatan antara setengahC-terminal VirG pada vir boxes mengaktifkan transkripsi dari loci vir yang lainnya. (Gb. 6)

1.2.3    Proses dan Transfer T-DNA

Proses dan transfer dari T-DNA dimediasi oleh produk-produk yang dikode oleh gen-gen pada wilayah vir (vir-region). Setelah induksi vir gen, produksi transfer tingkat lanjut dimulai dengan pembentukan T-strand, yaitu duplikat dari single stranded (ss) T-DNA (74). Banyak produk gen bertanggung-jawab dalam proses ini. Produk dari loci virC dan VirD terlibat dalam pembentukan dan pemrosesan T-strand. VirD1 dan VirD2 bersama-sama mengenali susunan pembatas 25 bp dan memproduksi sebuah belahan endonukleotik ss pada strand bagian bawah dari masing-masing pembatas (25, 27). Sayatan ini digunakan sebagai tempat inisiasi dan terminasi dalam memproduksi T-stand. Setelah penyayatan, VirD2 tetap terhubung kuat dengan ujung 5’ dari T-strand (35). Pengikatan  VirD2 pada ujung 5’ memberi karakter polar pada T-strand yang menjamin bahwa pada langkah berikutnya,  ujung 5’ merupakan leading end. Produksi T-strand diperkirakan merupakan hasil dari perpindahan strand bagian bawah dari T-DNA di antara  sayatan tersebut. Studi terbaru mengungkapkan bahwa langkah awal produksi T-strand secara evolusioner terkait dengan sistem bakteri yang memproduksi ssDNA, seperti salah satunya selama proses konjugasi (60). Dua protein lainya, VirC1 dan VirC2 kemungkinan berinteraksi dengan VirD1 dan VirD2 selama penyayatan berlangsung. Lokus virC, yang mengkode dua produk yaitu VirC1 (23 kDa) dan VirC2 (26 kDa), digunakan untuk meningkatkan proses penyayatan batas dari T-DNA (81, 82, 89).

T-strand harus bergerak melalui membran dan ruang seluler sebelum sampai pada inti sel tanaman dan tetap menjaga integritasnya selama proses ini. Oleh karena itu, adalah sebuah hipotesis bahwa T-strand seolah-olah bergerak seperti sebuah kompleks protein-ssDNA. VirE2 merupakan sebuah protein yang memiliki ikatan asam nukleat ss yang dapat diinduksi (inducible ss nucleic acid-binding protein), yang dikode oleh lokus virE yang terikat tanpa kespesifikan susunan. Sejumlah besar VirE2 (60 kDa) berada dalam sel dan terikat kuat serta saling bekerja sama, yang berarti bahwa sebuah T-strand akan terlapisi secara keseluruhan (Gb. 7). Satu molekul VirE2 diperkirakan melapisi sekitar 30 nukleotida, oleh karena itu 20 kb T-strand akan membutuhkan 600 molekul VirE2 (52). Akibatnya, degradasi T-strand oleh nukleasi akan dicegah dengan ikatan VirE2 dan bahkan, ikatan in vitro virE2 membuat ssDNA resisten terhadap degradasi nuckleolitik. T-strand bersama-sama VirD2 dan virE2 membentuk T-kompleks.

Kemudian, T-komplek harus keluar dari sel bakteri, melewati membran dalam dan luar dan juga dinding sel bakteri (Gb. 7). Perpindahan T-kompleks dari Agrobacterium merupakan salah satu tahapan pada proses transfer yang kurang dikenal. Studi terdahulu mengungkapkan bahwa virB dibutuhkan untuk tumorigenesis tetapi tidak untuk pembentukan T-strand atau T-kompleks (73). Penyusunan virB menunjukan bahwa produk gennya kemungkinan terlibat dalam proses transfer (90). Ada 11 Open Reading Frames (OPR) virB  untuk protein dengan perkiraan berat molekuler berikut ini; VirB1 (26 kDa); VirB2 (12 kDa); VirB4 (87 kDa); VirB5 (23 kDa); VirB6 (32 kDa); VirB7 (6 kDa); VirB8 (26 kDa); VirB9 (32 kDa); VirB10 ( 42 kDa); VirB11 (38 kDa) (47,71). Kesebelas OPR dari lokus VirB ini mengkode protein yang menunjukan perkiraan fitur-fitur (features) yang dibutuhkan untuk membentuk sebuah alat ekspor yang terasosiasi pada membran, termasuk hidrophobisitas, wilayah jangkauan membran (membran-spanning domain), dan/atau susunan sinyal N-terminal yang menargetkan protein untuk keluar dari sitoplasma. Studi lokalisasi subseluler mengkonfirmasi asosiasi membran dari tujuh protein VirB (79, 3, 80). Namun, keseluruhan dari tujuh protein ini disalurkan di antara membran dalam dan luar, dalam proporsi yang bervariasi tergantung pada metode fraksinasinya. Dengan membandingkan susunannya, virB menunjukan hubungan yang evolusioner dengan kumpulan gen bakteri lain yang produk-produknya membentuk asosiasi membran kompleks yang terlibat dalam fimbriae, sekresi protein, atau pengambilan DNA (DNA uptake) (42). Wilayah Tra2 dari RP4 juga mengkode 11 protein yang terlibat dalam tahapan transfer DNA konjugasi, yang mungkin membentuk pilus atau prekursor pilus. Enam dari protein Tra2 sangat mirip dengan protein VirB, terutama fitur-fitur yang menunjukan lokalisasi membran (48).

Walaupun sebuah saluran ekspor spesifik diperkiraan merupakan produk-produk VirB, namun belum diketahui sedikit pun tentang detail penyusunan (assembly), struktur, atau fungsi dari produk-produk tersebut. Hubungan antara produk-produk VirB dan ekspor T-kompleks masih belum terpecahkan. Dalam transfer DNA yang bersifat konjugatif, pilus berperan menghubungkan sel resipien. Namun, apakah produk-produk VirB ini berperan dalam pengenalan permukaan sel tanaman masih belum diketahui.

1.2.4    Integrasi T-strand ke Genom Tanaman

Integrasi T-strand ke dalam sebuah kromosom inang merupakan tahapan akhir dalam proses transfer T-DNA (Gb. 7). Integrasi T-strand membutuhkan pengambilan inti (nuclear uptake). Protein yang berukuran lebih besar dari kira-kira 40 kDa membutuhkan NLS (nuclear localization signal) yang memediasi pengambilan inti (34). T-kompleks memiliki 3 komponen yang dapat menyumbang secara potensial sinyal untuk pengimporan inti (91). T-strand sendiri sepertinya tidak memiliki sinyal untuk mengimpor inti, karena beberapa DNA yang berada di antara susunan pembatas (border sequensces) akan ditransfer. Pemindahan inti dari T-kompleks sepertinya dimediasi oleh protein asosiasinya, VirD2 dan VirE2. Analisis susunan VirD2 mengungkapkan bahwa 85% N-terminal terlindungi dalam strain Agrobacterium; C-terminal hanya 25% terlindungi, tetapi persamaan yang sangat nyata terdapat pada 30 asam amino terakhir (90). Dalam wilayah ini, ditemukan susunan yang homolog dengan NLS tipe bipartite (34).  Fungsi lokalisasi  inti dari susunan ini dikonfirmasi dengan penyatuan wilayah pengkodean (coding region) dengan gen reporter β glukoridase (GUD) dan mengekspresikan sementara konstruk ini dalam protoplasma tembakau (34). Lokalisasi inti dari protein fusi diduga berasal dari akumulasi produk GUS biru pada inti sel. Ketika NLS yang diduga dihapus dari untaian penuh VirD2 dan digabungkan dengan GUS, maka produk GUS hanya ada dalam sitoplasma. Akumulasi inti dari ekspresi sementara VirD2 juga telah ditunjukkan dengan imunolokalisasi(78).

T-kompleks merupakan kompleks nukleoprotein yang sangat besar. Di beberapa strain Agrobacterium, T-strand panjangnya mencapai 20 kb (65). T-strand ini akan mengikat sampai sekitar 600 molekul virE2 dan memiliki panjang terhitung 3600 nm, yaitu 60 kali ketebalan membran inti. Termasuk sebuah VirD2, T-kompleks memiliki massa 50x10⁶ D (70). Apakah sebuah NLS bipartite yang tidak berpasangan dari VirD2 mampu memediasi pengambilan inti pada T-kompleks yang sangat besar? Jika tambahan NLSs diperlukan untuk pengambilan inti, NLSs dapat dipasok dari VirE2, komponen protein yang paling berlimpah dari T-kompleks. Analisis susunan menunjukkan dua NLSs bipartite yang potensial dalam VirE2 (12). Seperti halnya VirD2, lokalisasi inti VirE2 diuji dengan menggabungkan wilayah pengkodeannya dengan GUS. Walaupun mutan-mutan di mana salah satu NLSs atau yang lainnya dihapus menunjukkan beberapa transpor inti, kedua NLSs dibutuhkan untuk akumulasi maksimum dalam inti sel (12). Jadi, VirE2 menyediakan NLSs di sepanjang T-kompleks. NLSs ganda pada VirE2 kemungkinan bermanfaat secara fungsional untuk impor inti T-kompleks yang tak terputus/terganggu, seperti contohnya, untuk menjaga sisi sitoplasma dan nukleoplasma secara simultan dari pori-pori inti terbuka.

Mekanika integrasi T-strand ke dalam genom tanaman sebagian besar belum diketahui. Disarankan bahwa ikatan VirD2 dengan ujung 5’ pada T-strand bergabung dengan sayatan pada DNA tanaman. DNA tanaman akan lebih terbuka untuk membentuk sebuah celah, dan ujung 3’ dari T-strand kemungkinan berpasangan dengan wilayah lain dari DNA tanaman. Reaksi-reaksi ini akan menghasilkan T-strand ke dalam satu strand dari DNA tanaman. Strain yang terpilin kemudian akan menimbulkan sebuah sayatan pada strand yang berlawanan dari DNA tanaman. Reparasi celah dan sintesis DNA menggunakan T-strand sebagai cetakan, menghasilkan produk integrasi akhir. Namun, belum diketahui apapun tentang enzimologi proses integrasinya. Tidak ada faktor-faktor tanaman yang terlibat dalam proses ini. VirD2 dan VirE2 dianggap mengkatalisasi integrasi T-strand kedalam genom tanaman; namun, tidak ada data yang mendukung hipotesis ini.

Mekanisme Molekuler Induksi Tumor Crown Gall oleh Agrobacterium tumefaciens (PART 1)

1.1 PENDAHULUAN

1.1.1    Penyakit Tumor Crown Gall

Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium tumefaciens (Gb. 1). Transformasi tumor Crown gall akan terus berlangsung jika tidak terdapat serangan bakteri (7, 56, 65). Awal abad ini, ketertarikan untuk meneliti Agrobacterium didasarkan pada kemungkinan bahwa studi tentang Crown gall ini bisa mengungkap mekanisme yang juga berlangsung dalam neoplasia hewan. Akhir-akhir ini, pertumbuhan tumor ditunjukkan oleh hasil ekspresi gen dari Agrobacterium asal yang ditransfer, dan menjadi terintegrasi secara stabil pada genom tanaman (14). Karakterisasi molekuler dari induksi Crown gall ini menunjukkan bahwa Agrobacterium bisa dipakai untuk menghantarkan materi genetik kedalam tanaman dan hal ini menjadi ketertarikan baru dalam studi Agrobacterium tumifaciens. Pengetahuan tentang tumor Crown gall berkembang dengan pesat secara meluas akhir-akhir ini karena teknik-teknik molekuler biologinya. Sekarang ini, sistem transfer DNA dari Agrobacterium ke tanaman dimanfaatkan secara meluas untuk penelitian biologi molekuler dan rekayasa genetika pada tanaman.

1.1.2    Sifat-sifat Agrobacterium tumefaciens

Agen penyebab (causative agent) penyakit Crown gall, yaitu Agrobacterium tumifaciens, digolongkan  kedalam famili Rhizobiaceae yang dibagi seperti ditunjukkan pada Gb.2. Sebagian besar genus Agrobacterium menyebabkan tumor pada tanaman dikotil. Spesies Agrobacterium tergolong bakteri gram-negatif yang merupakan bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0.6-1.0 µm sampai 1.5-3.0 µm, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28^◦C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen (46).

A. tumafaciens mengandung sebuah plasmid besar yang disebut Ti-plasmid. Sebuah Ti-plasmid bertanggung jawab pada proses onkogenesitas A. tumefaciens. Namun, Ti-plasmid sendiri tidak mampu menyebabkan terjadinya transformasi pada tanaman. Gen-gen pada kromosom dari A. tumifaciens juga menyumbangkan fungsi lain yang berguna untuk onkogenesitas in planta (57, 65). Ti-plasmid hidup secara stabil dalam tubuh bakteri meskipun ukurannya yang besar (200-900 kb) (33). Sebuah wilayah T-DNA (DNA yang ditransfer) diduplikasi dan ditransfer ke sel tanaman. Walaupun T-DNA merupakan elemen yang mudah berpindah, T-DNA bukanlah elemen yang dapat diubah urutannya, karena T-DNA sendiri tidak mengkode produk yang memediasi perpindahannya. Sebagai gantinya, sebuah komponen kedua, yaitu wilayah virulen (vir) pada Ti-plasmid, menyediakan sebagian besar produk trans-acting untuk transit T-DNA.

1.1.3    Induksi Crown gall oleh A. tumefaciens

Peristiwa pembentukan tumor Crown gall yang diakibatkan oleh Agrobacterium digambarkan pada Gb. 4. A. tumefaciens menyerang tanaman pada bagian yang luka. Pengirim pesan kimia (chemical messengers), biasanya senyawa fenolik seperti acetosyringone, yang berasal dari sel tanaman yang luka, mempengaruhi transkripsi gen virulen Ti plasmid-borne yang dihasilkan di dalam bakteri (5, 72). Produk-produk gen vir mempengaruhi transfer T-DNA ke sel tanaman. T-DNA mengkode enzim auksin, sitokinin, biosintesis; fitohormon ini menggangu keseimbangan hormon pada tanaman inang, sehingga terbentuklah tumor. T-DNA juga mengkode enzim-enzim yang mensintesa senyawa yang tidak lumrah yang disebut ”opines”. Opines hanya dapat digunakan oleh Agrobacterium yang membawa Ti-plasmid, sebagai sumber karbon dan nitrogen, tetapi tidak dapat digunakan oleh tanaman inang dan mikroorganisme lainnya. Dengan demikian, proses transformasi membentuk suatu ekologi yang bisa ditempati (ecological niche) untuk bakteri, yang merupakan sejenis transformasi parasitis yang disebut ” kolonisasi genetik” (64, 70)

Mengenal Teknik DNA Sequencing

Mengenal Teknik DNA Sequencing

Meskipun begitu, teknik lama berbasis chain-termination masih umum digunakan, bahkan sangat efisien untuk menentukan sekuen DNA fragmen pendek (masih dalam hitungan kilobasa). Jadi ditemukannya teknik DNA Sequencing yang lebih canggih tidak serta merta bakal menggusur mesin-mesin capillary sequencing yang sudah “merajalela” di berbagai laboratorium biologi molekuler di seluruh dunia.

Artikel ini akan membahas prinsip dasar dan protokol DNA sequencing berbasis metode chain-termination menggunakan mesin automated capillary sequencer.

Prinsip Dasar DNA Sequencing

DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

· Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR

· ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.

Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini?

Cara Klasik

Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.

Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.

Prinsip Sanger Method dengan primer labelling

Dye Primers dengan Label Berbeda

Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?

Dye-Terminators Sequencing

Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.

Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya.

Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini –meskipun kini tergolong “lambat” setelah ditemukannya high-throughput sequencing– akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.

Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing

Ekstraksi DNA untuk DNA sequencing

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.

Desain Primer dan Amplifikasi

Urutan kerja DNA sequencing secara umum mengharuskan kita mengamplifikasi hasil ekstraksi DNA sample sebelum disekuen. Untuk mengamplifikasi DNA sample, kita membutuhkan DNA polymerase, nukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler.

Sequencing Chemistries

Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.

Sequencing menggunakan Dye Primers

Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dye fluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).

Sequencing menggunakan Dye Terminators

DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (gambar 3).

BigDye® Cycle Sequencing Chemistries

BigDye® primers dan terminators mengutilisasi molekul-molekul transfer energi tunggal, yang mencakup sebuah pewarna (dye) donor dan akseptor energi yang terhubung oleh sebuah penghubung (linker) transfer energi yang sangat efisien. Dalam struktur molekul BigDye®, akseptornya adalah sebuah dye dichlororhodamine. Dye dichlororhodamine (dRhodamine) merupakan suatu penyempurnaan atas dye rhodamine konvensional. dRhodamine terpisah lebih baik secara spektral — terdapat overlap spektral yang jauh lebih sedikit pada panjang gelombang eksitasi maksimumnya, dan produk sequencing yang dihasilkan memperlihatkan background noise yang jauh berkurang. Sehingga menghasilkan signal yang lebih bersih dan akurasi base calling yang lebih besar pada pembacaan yang lebih panjang. Suatu linker transfer energi meng-couple fluorescein donor dan dye dRhodamine akseptor untuk transfer energi yang efisien dalam satu molekul tunggal. Dye yang lebih terang dan bersih ini menghasilkan sebuah sequencing chemistry yang sesuai untuk kebanyakan aplikasi.

Pemurnian sample

Setelah reaksi sequencing, sangat penting untuk membuang dye terminators yang tidak menempel dan garam-garam yang dapat berkompetisi saat injeksi elektrophoresis kapiler. Terminator yang tidak menempel dapat turut bermigrasi bersama template sequencing, mengakibatkan basecalling errors dan kelebihan garam mengakibatkan rasio signal-to-noise menjadi buruk.

Elektroforesis

Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencing diinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.

Beberapa saat sebelum mencapai elektroda positif, fragmen DNA terlabel fluorescent yang terpisah berdasarkan ukuran, bergerak melalui lintasan sinar laser. Sinar laser menyebabkan dye pada fragmen berpendar. Sebuah alat pendeteksi optis pada mesin DNA analyzer mendeteksi fluorescent (gambar 5). Software Data Collection mengkonversi signal fluorescent menjadi data digital, kemudian merekam datanya dalam sebuah file *.ab1. Karena masing-masing dye mengemisikan cahaya pada panjang gelombang yang berbeda ketika tereksitasi oleh laser, sehingga keempat warna yang mewakili keempat basa dapat dideteksi dan dibedakan dalam satu injeksi kapiler.

Analisa Data

Setelah elektroforesis, software Data Collection membuat sebuah file sample dari data mentah. Dengan menggunakan aplikasi software, analisa data selanjutnya diperlukan untuk menterjemahkan image data warna yang diperoleh menjadi basa-basa nukleotida yang berhubungan.

Analisa Primer

Tool-tool ini mengkonversi gambar yang diperoleh selama Data Collection menjadi empat warna, yang merepresentasikan keempat basa nukleotida yang berhubungan (gambar 1). Sebagai contoh, Software Sequence Analysis adalah perangkat analisa primer yang harus digunakan setelah pengumpulan data selesai. Aplikasi software Sequence Analysis memungkinkan pengguna untuk melakukan basecall dan basecall ulang, memotong ujung data, menampilkan, menyunting dan mencetak file-file sample. Software analisa primer memproses data mentah pada file *.ab1 menggunakan algoritma dan menerapkan pengaturan analisa berikut kepada hasil:

Basecalling

Koreksi Pergeseran Mobility

File Mobility mengkompensasi perubahan dalam mobilitas fragmen DNA yang disebabkan oleh molekul dye yang terikat pada fragmen DNA dan mengubah penetapan warna basa-basa bergantung pada jenis chemistry yang digunakan untuk melabel DNA.

Quality Value (QV)

Jika menggunakan KB basecaller untuk analisa, software memberikan suatu QV untuk setiap basa. QV memprediksi probabilitas suatu galat basecall. Contohnya, suatu QV 20 memprediksi tingkat galat 1%. Algoritma pemrediksi kualitas dikalibrasi untuk memperoleh QV yang memenuhi hubungan standar-industri yang ditetapkan oleh software Phred. Jika alur kerja kita mencakup analisa menggunakan software Phred untuk memberikan QV setelah data di-basecall, kita dapat menyederhanakan workflow dan menggunakan KB Basecaller saja. KB Basecaller dapat melakukan basecalling dan memberikan QV. Kemudian, kita dapat membuat file *.phd.1 atau *.scf menggunakan KB Basecaller untuk diintegrasikan dengan workflow kita.

Analisa Sekunder

Tool-tool ini memungkinkan kita untuk lebih menyempurnakan hasil. Algoritma dalam produk-produk software analisa sekunder melakukan sejumlah aplikasi pendukung fungsi-fungsi seperti deteksi mutasi dan genotyping, dan menghasilkan output-output grafis.

Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing

1. Apakah Sanger Dideoksi Sequencing itu dan apa bedanya dengan Fluorescent Sequencing Applied Biosystems?

DNA polymerase dapat berinkorporasi juga dengan basa nukleotida analognya. Metode dideoksi pada DNA sequencing yanG dikembangkan oleh Sanger et al. (1977) memanfaatkan keuntungan kemampuan ini dengan menggunakan 2′-3′-dideoksi sebagai substrat. Ketika sebuah dideoksinukleotida berinkorporasi pada ujung 3′ rantai yang sedang memanjang, pemanjangan rantai dihentikan secara selektif pada A, C, G atau T, karena rantai kekurangan gugus 3′-hidroksil (lihat gambar 8).

Gambar 8: Empat warna/sequencing fluorescent satu lajur vs Satu warna/Sequencing Empat Lajur

2. Apakah Cycle Sequencing itu?

Cycle Sequencing adalah sebuah metode sederhana dimana pengulangan denaturasi, annealing dan ekstensi secara berturut-turut dalam thermal cycler menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi (lihat gambar 9). Produk ini kemudian di-load kedalam del atau diinjeksikan ke dalam kapiler. Applied Biosystems menggunakan protokol cycle sequencing ini dalam kit DNA sequencingnya.

3. Apakah keuntungan dari cycle sequencing?

Keuntungannya adalah sebagai berikut:

· Protokolnya sangat baik dan mudah untuk dilakukan

· Cycle sequencing membutuhkan DNA template yang jauh lebih sedikit dibandingkan metode ekstensi temperatur tunggal.

· Cycle sequencing lebih sesuai dibandingkan metode pelabelan temperatur tunggal tradisional yang membutuhkan langkah denaturasi kimiawi untuk template utas ganda.

· Temperatur yang tinggi mengurangi struktur sekunder sehingga ekstensi berjalan lebih sempurna

· Temperatur tinggi mengurangi annealing sekunder primer ke template

· Protokol yang sama digunakan untuk DNA utas ganda maupun utas tunggal

· Protokol ini bekerja dengan baik untuk sequencing langsung PCR produk

· Template-template yang sulit, seperti bacterial artificial chromosomes (BACs), dapat disekuen

4. Apakah Dye Terminator Cycle Sequencing itu?

Dengan pelabelan dye terminator, masing-masing keempat dideoxy terminators (ddNTPs) ditandai dengan suatu fluorescent dye yang berbeda-beda. Rantai yang tumbuh diterminasi dan dilabel secara simultan dengan dye yang berkorespondensi dengan basa tersebut (lihat gambar 10). Suatu primer yang tidak dilabel dapat digunakan. Reaksi dye terminator dapat dilakukan dalam sebuah tabung. Protokol ini membutuhkan langkah pemipetan yang lebih sedikit dibanding reaksi dye primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load dalam sebuah lajur gel tunggal atau satu injeksi kapiler. Jika terjadi kesalahan terminasi, yaitu fragmen yang tidak diterminasi oleh dideoksinukleotida, maka tidak akan terdeteksi karena tidak ada dye yang menempel.

5. Apakah Dye Primer Cycle Sequencing itu?

Dengan pelabelan dye primer, primer ditandai dengan empat pewarna fluorescent yang berbeda. Produk terlabel terbentuk dalam empat reaksi spesifik basa yang berbeda. Produk dari keempat reaksi ini lalu dicampur dan di-load kedalam satu lajur gel atau satu injeksi kapiler (lihat gambar 11). Dye primer chemistries umumnya menghasilkan intensitas sinyal yang lebih baik dibanding dye terminator chemistries. Primer yang terlabel tersedia secara komersial untuk situs-situs primer yang umum. Kita dapat juga melabel custom primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load ke dalam lajur tunggal atau satu injeksi kapiler.

6. Apakah Matrix Standard itu?

Overlap spektral yang presisi antara keempat dye diukur dengan menjalankan (running) fragmen DNA yang dilabel menggunakan masing-masing dye dalam kalibrasi spektral pada mesin ABI PRISM® Genetic Analyzer. Fragmen DNA yang dilabel dye ini dinamakan matrix standards. Software Data Utility kemudian menganalisa data dari sample matrix standard dan membuat file matrix. Nomor-nomor ini adalah internetan fluorescent yang dinormalisasi dan merepresentasikan suatu deskripsi matematis overlap spektral yang teramati diantara dye-dye. File-file matrix dalam file instrumen digunakan untuk jenis chemistry yang spesifik, dan menyediakan informasi bagi software Sequence Analysis sehingga memungkinkannya untuk mengkoreksi overlap spektral.

7. Apakah BAC End-Sequencing itu?

Bacterial artificial clones alias BAC adalah segmen besar DNA (100kb-200kb) yang diklonkan ke dalam bakteri dari spesies lain. Beberapa salinan dapat dibuat setelah kloning. Sekuen dari ujung BAC menyediakan penanda yang sangat spesifik. Sekuen ini kemudian dapat dibandingkan dengan pustaka BAC untuk konformasi.

8. Apakah yang dimaks dengan “Checking Clone Constructs”?

Ini merupakan cara untuk memverifikasi bahwa DNA yang kita inginkan sudah diklon dengan baik kedalam vektor menggunakan DNA sequencing.

9. Apakah Multicomponent Analysis itu?

Multicomponent analysis merupakan proses yang memisahkan keempat warna dye fluorescent menjadi komponen-komponen spektral tersendiri. Meskipun setiap dye mengemisikan fluoresensi maksimumnya pada panjang gelombang yang berbeda, terdapat beberapa overlap pada spektrum emisi antara keempat dye (lihat gambar 12). Tujuan multicomponent analysis adalah mengisolasi signal dari setiap dye sehingga noise pada data menjadi sesedikit mungkin.

10. Apakah De Novo Sequencing itu?

Proses eksperimental penentuan urutan basa nukleotida suatu daerah (region) DNA dengan melabel setiap nukleotida dengan penanda fluorescent untuk mengidentifikasinya.

11. Apakah yang dimaksud dengan Multi-Locus Sequence Typing (MLST)?

MLST adalah suatu prosedur yang tidak ambigu untuk mengkarakterisasi isolat bakteri menggunakan sekuen fragmen internal dari 7 gen housekeeping. Prosedur ini menggunakan fragmen internal (~450-500 bp) dari setiap gen, sehingga mereka dapat disekuen pada kedua utasnya secara akurat dengan mesin DNA sequencer terotomatisasi. Untuk setiap gen housekeeping, sekuen-sekuen yang terdapat dalam suatu spesies bakteri dinyatakan sebagai alel yang jelas, dan untuk setiap isolat, alel pada masing-masing ketujuh loci mendefinisikan profice allelic atau jenis sekuen (IST)

12. Apakah yang dimaksud dengan Deteksi berbasis SNP atau Resequencing?

Sebuah heterozygote mengandung alel-alel yang berbeda pada suatu locus (posisi) pada kromosom homolog. Deteksi heterozygote dilakukan dengan primer spesifik.

13. Apakah HLA Typing itu?

Pengujian human leukocyte antigen (HLA) mendeteksi antigen-antigen (penanda genetik) pada sel darah putih. Terdapat 4 jenis human leukocyte antigens yaitu: HLAA, HLAB, HLAC, dan HLAD. Tes HLA menguji kompatibilitas jaringan dan penentuan jenis jaringan reseptor/donor. Tes ini juga digunakan pada konseling genetik dan pengujian paternitas. (hanya untuk riset.)

14.apakah Deteksi Metilasi itu?

Metilasi DNA terjadi pada situs CpG, yang mana sekuen DNA dengan sitosin berada dekat dengan guanin. Metilasi dimediasi oleh suatu enzim (DNA methyltransferase). Situs CpG jarang terdapat pada genom eukariot, kecuali pada wilayah yang dekat dengan promoter suatu gen eukariotik. Wilayah ini dikenal sebagai CpG islands, dan keadaan metilasi pada situs-situs CpG penting bagi aktifitas/ekspresi gen.

15. Apakah mtDNA sequencing itu?

mtDNA adalah kependekan dari mitokondria. Molekul mitokondrial terdapat dalam jumlah 100-1000 salinan per sel, lain dengan DNA inti yang terdapat hanya dua salinan per sel. Banyaknya mtDNA memungkinkan diskriminasi antara individu-individu atau sampel-sampel biologis, khususnya jika DNA inti rusak atau tidak tersedia.

16. Apakah yang dimaksud dengan Comparative Genomic Resequencing?

Comparative Genomic Resequencing adalah perbandingan genom-genom dan individu-individu dalam suatu genom. Comparative genomics memungkinkan aplikasi informasi yang diperoleh dari suatu genom sampel menjadi suatu genom yang lebih kompleks. Ini merupakan dasar untuk memahami variasi genetik dalam suatu populasi.

17. Apakah Metode SAGE™ itu?

SAGE™ adalah sebuah motede untuk analisa kuantitatif, pola ekspresi gen pada genome. Suatu tag sekuen pendek (10 – 25 bp) mengandung informasi yang cukup untuk mengidentifikasi suatu transkrip.

18. Apakah yang dimaksud dengan profiling mutasi menggunakan analisa, deteksi atau validasi SNP itu?

Sebuah single nucleotide polymorphism (SNP) adalah substitusi satu basa atas yang lainnya. Beberapa metode berbasis sequencing tersedia untuk pencarian dan analisa SNP.

DAFTAR PUSTAKA

http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/

http://sciencebiotech.net/mengenal-teknik-dna-sequencing/

http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/