Mekanisme Molekuler Induksi Tumor Crown Gall oleh Agrobacterium tumefaciens (PART 2)

1.2 PROSES-PROSES YANG TERLIBAT DALAM INDUKSI TUMOR CROWN GALL

Seperti yang telah disebutkan di atas, tumorigenesis dari Crown gall merupakan proses yang terdiri dari beberapa tahap termasuk penempelan Agrobacterium pada sel tanaman, proses dan transfer T-DNA ke sel tanaman diikuti oleh penggabungan dan pengekspresian gen-gen T-DNA di dalam genom tanaman.

1.2.1    Penempelan Agrobacterium pada Sel Tanaman

Tahap pertama dalam induksi tumor adalah pengikatan Agrobacterium pada sel tanaman. Peristiwa awal ini dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom bakteri. Strain yang membawa mutasi-mutasi sejumlah loci (chvA, chvB, att dan pscA atau exoC) kurang baik dalam penempelan sel tanaman, sehingga dikatakan avirulen atau sangat lemah sifat racunnya (8, 21, 53, 77, 83). Gen-gen kromosom, chvA, chvB, dan exoC, diperlukan dalam sintesis dan penyaluran  β-1,2-glucan cyclic yang terlibat dalam pengikatan sel tanaman. Protein chvB terlibat dalam biosintesis glucan (67), sementara chvA diperlukan untuk memindahkan glucan dari sitoplasma ke periplasma dan ruang ekstraseluler. ChvA memiliki kesamaan dengan  golongan ATPase yang terikat pada membran (membrane-bound ATPase) yang terlibat dalam transpor aktif (22). Walaupun produk-produk dari chvA dan chvB terlibat dalam biosintesis dan transpor β-1,2-glucan, namun masih belum jelas apakah glucan terlibat dalam penempelan Agrobacterium atau mempengaruhi sifat-sifat lain dari permukaan sel yang terlibat secara langsung.

Mutan-mutan att memiliki flagela, fimbriae dan mudah bergerak (motile) (53). Att normalnya memproduksi β-1,2-glucan dan tidak mengalami perubahan pada struktur polisakaridanya. Uji mendalam pada mutan-mutan ini menunjukan bahwa mutan-mutan ini kekurangan dua polipeptida (34 kDa dan 38 kDa), yang ditemukan pada membran luar atau ruang periplasma dari bakteri tipe liar (53). Namun, apakah salah satu dari dua polipeptida ini berperan secara langsung pada induksi tumor dengan cara memediasi proses penempelan, masih belum diketahui.

1.2.2    Induksi Gen-vir

Daerah vir kira-kira 30 kb dan tersusun dalam 7-8 komplementasi kelompok: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, dan virH (sebelumnya pinF) (73, 86). Gb. 5 menunjukan susunan genetik wilayah vir dari Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin. Perbedaan wilayah vir antara Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin adalah; virF dan virH (pinF) tidak terdapat pada Ti-plasmid tipe nopalin sementara tipe oktopin mengandung kedua gen tersebut.

Aktivasi transkripsi gen-gen vir merupakan hasil langsung dari penerimaan A. tumefaciens terhadap sinyal molekul yang diproduksi oleh sel tanaman yang luka, yang mana memicu sistem regulasi vir. Dua penginduksi potensial, acetosyringone dan hydroxy-acetosyringone, diisolasi dari sel akar tembakau oleh Stachel et al (72). Beberapa monosakarida juga memegang peranan penting pada induksi gen-gen vir (9). pH medium memiliki pengaruh yang kuat pada induksi vir; induksi akan optimal dalam rentang pH 5.0-5.4 dan tidak akan terjadi induksi pada pH 6.3 atau diatasnya (74). Regulasi gen vir juga dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom Agrobacterium. Gen virulen kromosomal yang dinamai chvD, chvE, ros, miaA, chvG, dan chvI telah dilaporkan terlibat dalam virulensi dengan cara mempengaruhi ekspresi gen-gen vir pada Ti-plasmid (85, 86, 89,36,28, 18, 10,51). chvD, ros, dan miaA memiliki peran yang sulit dimengerti dalam regulasi ekspresi gen vir. Penyelipan transposon pada chvE menyebabkan kisaran inang terbatas dan berkurang sifat racunnya. Induksi gen vir pada Ti-plasmid oleh acetosyringone berkurang sama sekali atau bahkan tidak terdapat dalam mutan chvE. Namun, induksi virG dengan kombinasi antara pH rendah dan konsentrasi posfat rendah tidak merusak mutan chvE  jika dibandingkan dengan tipe liar (wild type). Analisis susunan DNA menunjukkan bahwa chvE bisa mengkode protein ruang periplasmik yang terlibat dalam kemotaksis atau pengambilan gula (sugar uptake) (36). Mekanisme dimana protein ini mempengaruhi  induksi acetossyringone pada gen-gen vir masih belum diketahui. chvG dan chvI, anggota dari sistem regulasi dua komponen yang baru-baru ini diidentifikasi, juga terlibat dalam induksi gen vir dengan mekanisme yang belum diketahui (10,51).

Hal ini menunjukan bahwa gen-gen vir, virA dan virG yang esensial adalah regulator dari vir-regulon (86,1 ,55, 57). Protein VirA dan VirG harus melaksanakan setidak-tidaknya dua aktifitas yang berbeda. Yang pertama adalah kepekaan ekstraselular terhadap molekul sinyal tanaman dan transduksi dari sinyal lingkungan ini ke dalam bakteri. Yang kedua adalah pengaktifan beberapa vir-operon yang terpisah dalam merespon sinyal tanaman. Menariknya, protein regulasi virA dan VirG menunjukan kesamaan yang cukup berarti dengan beberapa protein bakterial yang termasuk dalam famili sistem regulasi positif dua komponen (87, 62). Produk VirA menyederhanakan protein membran bagian dalam yang peka dan merespon molekul sinyal tanaman seperti  acetosyringone (Gb. 6). Lebih lanjut, protein VirA merupakan kelompok kelas protein kinase histidin, dan mampu melakukan autoposporilasi (40, 58, 76). Pospat terikat pada sebuah residu histidine dari protein VirA. Hanya satu residu histidine yang terpelihara di antara protein-protein yang serupa. Ketika pengkodean kodon, residu ini (asam amino 474) diubah oleh site–directed mutagenesis menjadi glutamat, mutan virA ini tidak berfungsi dalam mengarahkan induksi gen vir dan mutan ini tidak bisa melakukan autoposporilasi (40). VirA yang mengalami autoposporilasi mentransfer pospat ke VirG (39). VirG adalah anggota protein perngatur respon (the respone regulator protein) (39), yang mana setengah dari N-terminalnya merupakan target dari posporilasi dan setengah C-terminalnya memiliki sifat pengikat promoter (promoter-binding properties) (54,62, 66). Pospat dilekatkan pada residu aspartat 52 dari protein VirG. Residu ini tersimpan dalam protein yang serupa dan dikenali sebagai tempat posporilasi (62). Perubahan aspartat ini menjadi asparagin menghilangkan kemampuan protein untuk menerima pospat dari VirA (39). Protein VirG digolongkan kedalam famili yang memiliki kesamaan susunan, yang disebut kotak vir (vir boxes), terletak pada bagian hulu (upstream) dari masing-masing promoter vir (66). Setengah bagian C-terminal dari protein virG bertanggung-jawab dalam pengikatan vir boxes (66). Penghilangan atau perubahan pada salah satu dari kedua vir boxes yang berada dalam gen VirG menghapus induksi dari promoter tersebut (63). Data yang sama  didapatkan saat vir boxes diubah atau dihapus dalam promoter virB, virC, VirD, dan virE (66,63, 61). Pengikatan antara setengahC-terminal VirG pada vir boxes mengaktifkan transkripsi dari loci vir yang lainnya. (Gb. 6)

1.2.3    Proses dan Transfer T-DNA

Proses dan transfer dari T-DNA dimediasi oleh produk-produk yang dikode oleh gen-gen pada wilayah vir (vir-region). Setelah induksi vir gen, produksi transfer tingkat lanjut dimulai dengan pembentukan T-strand, yaitu duplikat dari single stranded (ss) T-DNA (74). Banyak produk gen bertanggung-jawab dalam proses ini. Produk dari loci virC dan VirD terlibat dalam pembentukan dan pemrosesan T-strand. VirD1 dan VirD2 bersama-sama mengenali susunan pembatas 25 bp dan memproduksi sebuah belahan endonukleotik ss pada strand bagian bawah dari masing-masing pembatas (25, 27). Sayatan ini digunakan sebagai tempat inisiasi dan terminasi dalam memproduksi T-stand. Setelah penyayatan, VirD2 tetap terhubung kuat dengan ujung 5’ dari T-strand (35). Pengikatan  VirD2 pada ujung 5’ memberi karakter polar pada T-strand yang menjamin bahwa pada langkah berikutnya,  ujung 5’ merupakan leading end. Produksi T-strand diperkirakan merupakan hasil dari perpindahan strand bagian bawah dari T-DNA di antara  sayatan tersebut. Studi terbaru mengungkapkan bahwa langkah awal produksi T-strand secara evolusioner terkait dengan sistem bakteri yang memproduksi ssDNA, seperti salah satunya selama proses konjugasi (60). Dua protein lainya, VirC1 dan VirC2 kemungkinan berinteraksi dengan VirD1 dan VirD2 selama penyayatan berlangsung. Lokus virC, yang mengkode dua produk yaitu VirC1 (23 kDa) dan VirC2 (26 kDa), digunakan untuk meningkatkan proses penyayatan batas dari T-DNA (81, 82, 89).

T-strand harus bergerak melalui membran dan ruang seluler sebelum sampai pada inti sel tanaman dan tetap menjaga integritasnya selama proses ini. Oleh karena itu, adalah sebuah hipotesis bahwa T-strand seolah-olah bergerak seperti sebuah kompleks protein-ssDNA. VirE2 merupakan sebuah protein yang memiliki ikatan asam nukleat ss yang dapat diinduksi (inducible ss nucleic acid-binding protein), yang dikode oleh lokus virE yang terikat tanpa kespesifikan susunan. Sejumlah besar VirE2 (60 kDa) berada dalam sel dan terikat kuat serta saling bekerja sama, yang berarti bahwa sebuah T-strand akan terlapisi secara keseluruhan (Gb. 7). Satu molekul VirE2 diperkirakan melapisi sekitar 30 nukleotida, oleh karena itu 20 kb T-strand akan membutuhkan 600 molekul VirE2 (52). Akibatnya, degradasi T-strand oleh nukleasi akan dicegah dengan ikatan VirE2 dan bahkan, ikatan in vitro virE2 membuat ssDNA resisten terhadap degradasi nuckleolitik. T-strand bersama-sama VirD2 dan virE2 membentuk T-kompleks.

Kemudian, T-komplek harus keluar dari sel bakteri, melewati membran dalam dan luar dan juga dinding sel bakteri (Gb. 7). Perpindahan T-kompleks dari Agrobacterium merupakan salah satu tahapan pada proses transfer yang kurang dikenal. Studi terdahulu mengungkapkan bahwa virB dibutuhkan untuk tumorigenesis tetapi tidak untuk pembentukan T-strand atau T-kompleks (73). Penyusunan virB menunjukan bahwa produk gennya kemungkinan terlibat dalam proses transfer (90). Ada 11 Open Reading Frames (OPR) virB  untuk protein dengan perkiraan berat molekuler berikut ini; VirB1 (26 kDa); VirB2 (12 kDa); VirB4 (87 kDa); VirB5 (23 kDa); VirB6 (32 kDa); VirB7 (6 kDa); VirB8 (26 kDa); VirB9 (32 kDa); VirB10 ( 42 kDa); VirB11 (38 kDa) (47,71). Kesebelas OPR dari lokus VirB ini mengkode protein yang menunjukan perkiraan fitur-fitur (features) yang dibutuhkan untuk membentuk sebuah alat ekspor yang terasosiasi pada membran, termasuk hidrophobisitas, wilayah jangkauan membran (membran-spanning domain), dan/atau susunan sinyal N-terminal yang menargetkan protein untuk keluar dari sitoplasma. Studi lokalisasi subseluler mengkonfirmasi asosiasi membran dari tujuh protein VirB (79, 3, 80). Namun, keseluruhan dari tujuh protein ini disalurkan di antara membran dalam dan luar, dalam proporsi yang bervariasi tergantung pada metode fraksinasinya. Dengan membandingkan susunannya, virB menunjukan hubungan yang evolusioner dengan kumpulan gen bakteri lain yang produk-produknya membentuk asosiasi membran kompleks yang terlibat dalam fimbriae, sekresi protein, atau pengambilan DNA (DNA uptake) (42). Wilayah Tra2 dari RP4 juga mengkode 11 protein yang terlibat dalam tahapan transfer DNA konjugasi, yang mungkin membentuk pilus atau prekursor pilus. Enam dari protein Tra2 sangat mirip dengan protein VirB, terutama fitur-fitur yang menunjukan lokalisasi membran (48).

Walaupun sebuah saluran ekspor spesifik diperkiraan merupakan produk-produk VirB, namun belum diketahui sedikit pun tentang detail penyusunan (assembly), struktur, atau fungsi dari produk-produk tersebut. Hubungan antara produk-produk VirB dan ekspor T-kompleks masih belum terpecahkan. Dalam transfer DNA yang bersifat konjugatif, pilus berperan menghubungkan sel resipien. Namun, apakah produk-produk VirB ini berperan dalam pengenalan permukaan sel tanaman masih belum diketahui.

1.2.4    Integrasi T-strand ke Genom Tanaman

Integrasi T-strand ke dalam sebuah kromosom inang merupakan tahapan akhir dalam proses transfer T-DNA (Gb. 7). Integrasi T-strand membutuhkan pengambilan inti (nuclear uptake). Protein yang berukuran lebih besar dari kira-kira 40 kDa membutuhkan NLS (nuclear localization signal) yang memediasi pengambilan inti (34). T-kompleks memiliki 3 komponen yang dapat menyumbang secara potensial sinyal untuk pengimporan inti (91). T-strand sendiri sepertinya tidak memiliki sinyal untuk mengimpor inti, karena beberapa DNA yang berada di antara susunan pembatas (border sequensces) akan ditransfer. Pemindahan inti dari T-kompleks sepertinya dimediasi oleh protein asosiasinya, VirD2 dan VirE2. Analisis susunan VirD2 mengungkapkan bahwa 85% N-terminal terlindungi dalam strain Agrobacterium; C-terminal hanya 25% terlindungi, tetapi persamaan yang sangat nyata terdapat pada 30 asam amino terakhir (90). Dalam wilayah ini, ditemukan susunan yang homolog dengan NLS tipe bipartite (34).  Fungsi lokalisasi  inti dari susunan ini dikonfirmasi dengan penyatuan wilayah pengkodean (coding region) dengan gen reporter β glukoridase (GUD) dan mengekspresikan sementara konstruk ini dalam protoplasma tembakau (34). Lokalisasi inti dari protein fusi diduga berasal dari akumulasi produk GUS biru pada inti sel. Ketika NLS yang diduga dihapus dari untaian penuh VirD2 dan digabungkan dengan GUS, maka produk GUS hanya ada dalam sitoplasma. Akumulasi inti dari ekspresi sementara VirD2 juga telah ditunjukkan dengan imunolokalisasi(78).

T-kompleks merupakan kompleks nukleoprotein yang sangat besar. Di beberapa strain Agrobacterium, T-strand panjangnya mencapai 20 kb (65). T-strand ini akan mengikat sampai sekitar 600 molekul virE2 dan memiliki panjang terhitung 3600 nm, yaitu 60 kali ketebalan membran inti. Termasuk sebuah VirD2, T-kompleks memiliki massa 50x10⁶ D (70). Apakah sebuah NLS bipartite yang tidak berpasangan dari VirD2 mampu memediasi pengambilan inti pada T-kompleks yang sangat besar? Jika tambahan NLSs diperlukan untuk pengambilan inti, NLSs dapat dipasok dari VirE2, komponen protein yang paling berlimpah dari T-kompleks. Analisis susunan menunjukkan dua NLSs bipartite yang potensial dalam VirE2 (12). Seperti halnya VirD2, lokalisasi inti VirE2 diuji dengan menggabungkan wilayah pengkodeannya dengan GUS. Walaupun mutan-mutan di mana salah satu NLSs atau yang lainnya dihapus menunjukkan beberapa transpor inti, kedua NLSs dibutuhkan untuk akumulasi maksimum dalam inti sel (12). Jadi, VirE2 menyediakan NLSs di sepanjang T-kompleks. NLSs ganda pada VirE2 kemungkinan bermanfaat secara fungsional untuk impor inti T-kompleks yang tak terputus/terganggu, seperti contohnya, untuk menjaga sisi sitoplasma dan nukleoplasma secara simultan dari pori-pori inti terbuka.

Mekanika integrasi T-strand ke dalam genom tanaman sebagian besar belum diketahui. Disarankan bahwa ikatan VirD2 dengan ujung 5’ pada T-strand bergabung dengan sayatan pada DNA tanaman. DNA tanaman akan lebih terbuka untuk membentuk sebuah celah, dan ujung 3’ dari T-strand kemungkinan berpasangan dengan wilayah lain dari DNA tanaman. Reaksi-reaksi ini akan menghasilkan T-strand ke dalam satu strand dari DNA tanaman. Strain yang terpilin kemudian akan menimbulkan sebuah sayatan pada strand yang berlawanan dari DNA tanaman. Reparasi celah dan sintesis DNA menggunakan T-strand sebagai cetakan, menghasilkan produk integrasi akhir. Namun, belum diketahui apapun tentang enzimologi proses integrasinya. Tidak ada faktor-faktor tanaman yang terlibat dalam proses ini. VirD2 dan VirE2 dianggap mengkatalisasi integrasi T-strand kedalam genom tanaman; namun, tidak ada data yang mendukung hipotesis ini.